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1，紫外和可见分光光度计能做什么？
此应用，也叫“定量分析”，是zui常用的。
这是一种方法，通过与已知浓度的溶液比较，测定出未知浓度样品的浓度。
-例如，夏天在山中或海滨，冬天在滑雪场用的墨镜、遮光剂化妆品和衣服。当“透射比”被测量时，目标波长是否被真地切断，是很明显的。
-每种物质都有其自己的特征“光谱”。通过与已知物质的光谱比较，识别未知的样品。（鉴定）
你知道一个物质由分子组成，分子由一组原子组成吗？每个分子有自己的特征光谱（位置，强度等） 。尽管困难，以其光谱为基础的分子结构测定被许多大学和公司实验室进行。
2，比色分析
比色分析，又叫做吸光测定法，是根据物质颜色来分析的一种方法。现在，让我们看“颜色”是什么，“光”是什么，哪个显示颜色。
2-1 光和色
2-1-1 光、无线电和 X射线（关于光）的关系
当你被问光是什么的时候，你能立即做出回答吗？包围我们的“光” ，是一种电磁波，就像无线电和电视发出的无线电波，X光照片用的 X射线一样。
2-1-2 太阳光与激光光束的比较 （白光和单色光）
在上页表中显示的光的形式中，200-400nm 波长的光叫做紫外（UV） ，从400-6235494nm叫做可见（VIS），从 800nm到近 1 毫米是红外（IR）。zui重要的是，仅可见光才能被我们的眼睛看见，并认为是一个“颜色” ，就想它名字那样。波长决定了可见光的颜色：红、蓝等。
这就是彩虹中颜色的顺序一直是相同的。
包含所有波长的光，包括紫外，可见光和红外，叫做“白光” （例如，太阳光，白帜光等） 。另一方面，光的每种颜色（例如红、蓝等）叫做单色光。太阳光发出的白光通过使用例如“滤光片”或“棱镜”的工具可被分成 7 种类似彩虹的颜色（波长） 。作为对比，激光光束发出的光仅包括一种波长（也就是，一个单波长）。
★ 白光：包含所有波长的光；单色光：单波长的光
2-1-3 苹果为什么是红的？ （关于颜色）
牛顿思考为什么苹果从数上掉下。
这里，让我们思考为什么苹果看上去是红色的。
晚上在漆黑的房间里，苹果看上去是红色的吗？回答：不是。但是，同个苹果在灯打开后或大白天显红色。这说明我们需要光（这里，是白光）来看见“颜色” 。
为什么苹果看上去是红色的，而不是蓝色或黄色？
物质，例如苹果、汽车和衣服对颜色有偏好，就像我们一样。
当某种物质暴露于包含各种颜色的光（白光）中时，它吸收，并仅从光中保持了它zui爱的颜色（一个现象叫“吸收”）。 它不喜欢的光（ 叫做“补色”）被反射，这样就形成了我们眼睛中看到的物质的颜色。
换句话说，苹果喜欢蓝色、绿色，不喜欢红色。当它暴露于白光中时，它会吸收蓝色和绿色，看上去就像红色，红色就是补色。
记住：任何我们叫“颜色”的东西与“波长”有关。
★ 物质吸收特定波长的光。我们看见的是补色。
2-1-4 不可见光（紫外和红外）
从目前的阐述看，你知道可见光是什么吗？如果不知道，请温习。
光的形式是什么？指像红外和紫外那样不可见的，而不是可见光。
紫外光能造成皮肤癌和晒黑。紫外光，简称紫外，参见电磁波，波长范围从约400nm（上限）到约 100nm（下限） ，尽管定义不是那么严格（几十 nm或以下的叫做软 X-射线）。在光谱分析领域，200nm或以下的紫外区叫远紫外，300nm或以上的叫做近紫外。
通常，紫外和可见分光光度计能测量200nm开始的波长。
我们经常听到这个词， “红外”在日常生活术语中经常使用，例如远红外烤架。红外线指电磁波，波长范围从1毫米起（上限；注意：该范围的一部分与微波的次毫米波重叠）到约 800nm（下限） 。由于红外线有热效应，它也叫做热射线。这就是为什么红外线用于烤架的原因了。
尽管红外线的分类有很多，通常波长 2.5um 及以下叫做近红外，2.5-25um 波长叫红外，大于 25um波长的叫远红外。 尽管红外分光光度计用于红外测量，一些紫外和可见分光光度计甚至可以测量近红外区域的光。
2-2 忽略清洁会增加吸光率（朗伯-比耳定律）
你喜欢热带鱼吗？尽管它们很可爱，但打扫鱼缸是很麻烦的事，不是么？
A和B养鱼。A很爱干净，热带鱼的鱼缸总是很干净、清晰。相反，B很懒惰，鱼缸总是浑浊的。 他们的鱼缸放在靠窗的地方。由于 A 的鱼缸里的水很干净，从窗口射进来的大部分光可以通过鱼缸看见。然而，B的鱼缸的水很浑浊，很少有光透过鱼缸。从窗口进来的光透过鱼缸的比率称为“透射比”（T）。
“透射比” （%T） 通常以百分比形式表示。相反地，从窗口射进来的光被鱼缸里的水吸收的比率叫做“吸光率”（Abs）.
忽略清洁的鱼缸里浑浊的水吸收更多的光来阻挡其路径，增加吸光率，降低透射比。另一方面，鱼缸里干净的水能很好地传输光，其透射比接近 100%，吸光率几乎为零。
我们用数学公式来解释这个理论。透射比为I/I0，I0是从窗口进入的光，I是穿过鱼缸的光。另外，透射比为 10-ecL(公式 1)，L是鱼缸的宽度（光学路径长度），c是缸内水的浑浊度（浓度），e是常数（叫做“分子吸收常数” ） ，是物质*的（在这个例子中，物质产生了浑浊） 。由于吸光度是透射比倒数的对数，可由公式三表示，它与分子吸收系数，浓度和光学路径长度成正比。该公式称为朗伯-比耳定律。
2-3 颜色密度的测量（定量分析）
定量分析是一种分析方法，来测定某种物质（溶液）的含量。比如，我们每天喝的水包含金属，微量残留农药，有机物等。但我们无法目测来测定其含量。
通常，在吸光测定法中，着色试剂被添加至标本，由于与目标物质的反应产生的颜色程度可被观察到。事先准备标准溶液和标本（样品） ，然后添加着色剂，使目标物质被染色。样品的浓度是通过使用校正曲线，比较标准溶液和样品的吸光度来测定的。
让我们看一下测量自来水中的铁的步骤，作为例子。
2-3-1 样品和标准溶液
为了测量物质的浓度，通过将要测试的未知浓度标本（样品）与1 个已知浓度的标本（标准溶液）的比较来测定其浓度。当分析自来水中的铁时，自来水是样品，已知浓度的铁溶液是标准溶液。关于标准溶液，要准备一组不同铁浓度的溶液。
如果样品和标准溶液没有在相同的条件下准备和测量的话，无法获得正确的结果。例如，样品是自来水的话，标准溶液应当为水溶液，而不是酒精溶液。另外，如果样品里添加了酸，它同样应当添加至标准溶液中。
用于溶解物质的液体，例如水或酒精被称为“溶剂”，在该液体中溶解的物质例如铁，称为“溶质” 。如果溶剂和溶质的吸收发生在相同的波长，那就无法获得正确的结果。
由于水在可见和紫外区域没有吸收，所以它通常被使用。尽管有机溶剂也经常使用，由于大部分在紫外区（不是可见区）有吸收，因此使用它们的时候要小心。
2-3-2 魔幻成分（着色剂）
你在观察自来水的时候，能看见铁的颜色吗？ 比色分析是分析颜色的一种方法。如果颜色不可见（在可见区域） ，那么分析是无法进行的。所以，我们要做什么呢？必要的仅仅是用魔幻成分给铁染色。给溶液中目标物质染色的成分叫“着色剂”或“颜色试剂”。
自来水包含的铁越多，颜色就越深（高吸光度） 。相反，自来水中的铁越少，颜色越浅（低吸光度） 。由于每种成分都准备了不同的着色剂，应当根据分析成分正确使用。
2-3-3 校正曲线
溶液已经配好，现在测量程序要开始了。要测量的波长必须决定好。
由于这个问题在后面章节光谱中被解释，让我们继续。下一步是测量标准溶液的吸光度来获得校正曲线。这里，水平轴是浓度，纵轴是吸光度。为了获得该曲线，从低的铁浓度向高的铁浓度的顺序测量标准溶液。获得的浓度和吸光度的值进行绘图，形成下面图表。
这称为“校正曲线” 。尽管通常是线性的，如果浓度过低或过高，有可能是二次曲线（曲线向上或向下）。
在通过标准溶液测量而获得校正曲线以后，测量样品。在样品的吸光度测量后，通过与校正曲线的比较，可以测定其浓度。请见校正曲线图。从纵轴上的测量吸光度出发，在校正曲线上画出一条水平线，从该水平线的截距上画一条垂直线。该线上列出的值就是浓度。在定量分析中，样品的浓度是以这样的方式决定的。
2-4 观察颜色（光谱）
2-4-1 光谱是什么？
在定量分析中，通过比较物质吸收某波长光的多少来测定浓度的。在其他波长，它吸收多少？“光谱”显示物质在每个波长吸收的多少。
在紫外可见分光光度计中，可以测量发射光谱和吸收光谱。
光谱上的点，横坐标是波长，纵坐标是透射比或吸光度。请再次记住：在看下面发射和吸收光谱图的时候，注意发射和吸收的关系。
2-4-2 从光谱中能知道什么？
尽管铁的定量分析在前面的部分执行，哪个波长（nm）应当被真实地测量？ 由于有较大吸收的波长的灵敏度更高，我们希望选择尽可能有zui大吸收的波长。 这与吸收谱图有关。请看下面的谱图，是添加了着色剂的铁溶液。该谱图表明在510nm 附近的吸收是zui大的（zui大吸收处的波长称为zui大吸收波长） 。就表明铁浓度应当在510nm附近测量。
光谱的形状与添加了着色剂的铁溶液有特别关系（净吸收亮度随浓度变化）。 如果未知溶液的测量图谱与图中的光谱一致，就说明样品是加了着色剂的铁溶液。物质的特性通过测量其光谱来检验。
3 分光光度计的机理
3-1 人和机器的差异（普通机理）
你如何知道一个颜色有多厚多薄。就我们知道的，在紫外和可见波长范围（200-800nm）中物质能很好地吸收什么颜色（波长）？
尽管人类能通过感知物质的颜色或识别颜色的阴影预测总的吸收波长，但无法获得的波长估计，而且还有个体差异。另外，人眼无法看见紫外区。
由于这个原因， “紫外可见分光光度计”系统，没有个体差异，能够测量紫外区。
在分光光度计中，通过使用人造光源替代阳光，检测器和表替代人眼来测量颜色（波长） 。与人如何看见物质zui大的区别就是：在分光光度计中，白光不是直接照射到物体，而是利用棱镜或衍射光栅将光分成许多颜色，然后每种颜色（单色光）射到物体上（扫描）来测量该颜色的特定波长。
*在分光光度计中，白光分成单色光来测量吸收。
3-2 光学系统
3-2-1 有没有仅用于样品的位置？ （单光束和双光束）
在吸收测量中，每次样品和参比都进行测量和比较。
由于在单光束系统中只有 1 个位子用于测量， 样品和参比必须被交换，一个 100%调节（或0Abs调节）必须被进行，当测量波长变化时。
尽管系统主要用于定量测量，小的不贵的系统配置是可以实现的，光源波动（漂移）不能被补偿。
单光束系统只有一个测量位置，双光束系统包含的样品位置和参比位置。由于不需要更换样品和参比（不需要每次测量波长的变化后，100%或 0Abs 的调节），所以它适合定性和定量分析。
3-2-2 小心选择波长（单个单色和双单色）
掌管场所的人员负责严格检查入口的来客，比如“学生禁止进入” 。然而，有没有学生偷偷进入大厅呢？甚至检查员很好地检查了每个怀疑的进入者，但还是经常会听到这种情况下有人未经检查就进入了。
单色（单色器或分光镜）是一种机器，将需要的波长光从含有多波长的光中取出，扮演着在入口检查光的角色，可以这么说。但是，波长，不是要求的波长，会混入，尽管有检查（这个混入或损失的光被称为杂散光） 。在进行严格测试时，该杂散光可能会起到坏影响。所以，在双单色系统中，通过检查的光被再次检查。
在单个单色系统中，只检查一次。
3-3 分光光度计的部件
3-3-1 光源
两种类型的灯用于分光光度计光源：1 个氢放电管用于测量紫外区，1 个钨灯测量可见/近红外区域。
3-3-2 分光镜
分光镜从光源（白光）中选择单色光（也就是1 个波长）。
有 3 种分光镜：A 过滤型 B棱镜类型 C 光栅（衍射光栅）类型
3-3-3 样品池
放样品的容器通常叫做“池”，由玻璃或石英做成。玻璃池用来测量340nm以上的可见范围，因为它在紫外区波长 340nm或以下几乎不发射任何光。另一方面，石英池会发射所有波长的光，从整个紫外到可见区域。然而，由于石英池很贵，他们主要用于测量紫外区。
3-3-4 检测器
检测器的作用就是将样品的发射光转化成电信号。
有多种类型的检测器，包括 A光电池 B 光电倍增管等
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